In der Pharmaindustrie sind die Vorgaben der jeweilig geltenden Pharmakopöe (Pharmacopeia) von großer Bedeutung. Die Arzneibücher mit weltweit größter Relevanz sind dabei die USP (United States Pharmacopoeia), die Ph. Eur. (European Pharmacopoeia) und die JP (Japanese Pharmacopoeia). Durch die ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) wird zunehmend auch auf eine internationale Vereinheitlichung der Vorgaben hingearbeitet.
Ziel der Arzneibücher ist es, durch rechtlich bindende Vorschriften eine gleichbleibende und einheitliche Qualität der Ausgangsstoffe und Arzneimittel und somit eine sichere Anwendung für den Patienten gewährleisten.
Für die Analytik ist dabei der Monographieteil der jeweiligen Pharmakopöe relevant. In diesem wird unter anderem die Analysenmethode vorgegeben, anhand derer der Wirkstoff bestimmt werden soll. Viele dieser Methoden beruhen dabei auch auf der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC). In den Monographien wird dabei die stationäre und mobile Phase beschrieben, sowie die weiteren Chromatographiebedingungen wie z.B. Säulentemperatur, Injektionsvolumen etc. angegeben. Auch die von den Methoden erlaubten Abweichungen, ohne dass eine Revalidierung der gesamten Methode notwendig ist, werden durch das Arzneibuch geregelt.
Diese Seite möchte einen Überblick über die allgemeinen Regularien der für den deutschsprachigen Raum wichtigsten Arzneibücher, der Ph. Eur. und der USP bezüglich der HPLC-Analytik geben.
Sowohl Ph. Eur. als auch USP spezifizieren die stationäre Phase nach der „Chemie“ des Packungsmaterials. So entspricht z.B. eine Säule mit der Spezifikation USP L1 einer Reversed-Phase-Säule basierend auf Octadecylsilan (ODS), welches mit einer Partikelgröße von 1.5 – 10 µm chemisch an poröses oder nicht poröses Silica oder an keramische Mikropartikel gebunden oder aber auch in monolithischer Form vorliegen kann. Durch die stetige Weiterentwicklung in der HPLC-Analytik wurde und wird die Liste der Säulenspezifikationen dabei immer wieder erweitert. Aktuell beinhaltet die der USP über 70 verschiedene Füllmaterialien (s.u.).
In den Monographien wird die analytische Säule nur nach dieser Klassifizierung angegeben. Damit die Methode konform zu der jeweiligen Monographie bleibt, muss die Spezifikation der Säule zwingend eingehalten werden und darf nicht geändert werden. Ebenfalls vorgegeben sind die Dimensionen der zu verwendenden HPLC-Säule. Hier erlauben jedoch Ph. Eur. und USP einen gewissen Spielraum zur Methodenoptimierung (s. Erlaubte Abweichungen nach Ph. Eur. und USP).
Für die praktische Durchführung der Analyse bedeutet dies, dass nur die Säulenspezifikation beibehalten werden muss. In der Wahl der Dimensionen sind gewisse Freiheiten gestattet. Weitere Kenngrößen der stationären Phase wie z.B. Carbon Load oder endcapping der freien Silanolgruppen sind in den Monographien nicht vorgegeben. Dies ermöglicht es dem Anwender, eine analytische Säule gemäß seiner Anforderungen aus der Vielzahl der erhältlichen Säulen einer Kategorie zu wählen.
Um die Auswahl der chromatographischen Säule zu erleichtern bieten viele Hersteller die Möglichkeit, ihr Portfolio nach der USP L Nummer einzugrenzen. Eine herstellerübergreifende Alternative zur Suche geeigneter stationärer Phasen stellt der Säulenkonfigurator. Hier kann gezielt nach der USP L Nummer selektiert und die passenden Säulen der gängigen Hersteller miteinander verglichen werden.
Die mobile Phase als Gegenstück zur stationären Phase ist ebenfalls durch die Monographie festgelegt. Bei ihrer Zusammensetzung sind Änderungen zur Methodenoptimierung gestattet, sofern sie innerhalb des zulässigen Bereiches liegen (s. Erlaubte Abweichungen nach Ph. Eur. und USP).
Zu den weiteren chromatographischen Bedingungen zählen die Flussrate, die Säulentemperatur und das Injektionsvolumen. Aufgrund des Zusammenspiels der verwendeten HPLC-Säule mit ihren Dimensionen sind auch hier Abweichungen von den in der Monographie aufgeführten Bedingungen erlaubt (s. Erlaubte Abweichungen nach Ph. Eur. und USP).
Auch die Detektion ist Teil der Analyse. Am häufigsten wird dazu ein UV/Vis-Detektor bzw. DAD (Diodenarray-Detektor) eingesetzt. Bei diesen beruht die Detektion auf der Lichtabsorption der zu untersuchenden Substanzen bei bestimmten Wellenlängen. Eine Veränderung der in den Monographien angegebenen Wellenlängen ist daher nicht erlaubt.
Sowohl Ph. Eur. als auch USP gestatten die Modifizierung der in den Monographien aufgeführten Methoden. Erfolgt die Anpassung des/der Parameter innerhalb der zulässigen Grenzen, reicht der Nachweis der Systemeignung (System Suitability) aus, eine Revalidierung der geänderten Methode ist nicht notwendig. Ziel einer etwaigen Anpassung ist dabei grundsätzlich die Optimierung einer Methode dahingehend, dass die Anforderungen der Systemeignung erfüllt werden.
Nach aktuellem Stand sind dabei folgende Modifizierungen erlaubt:
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*Für Gradiententrennung wird eine Änderung der mobilen Phase nicht empfohlen. Hier sollte eine andere Säule der gleichen Spezifikation gewählt werden oder eine Anpassung des Totvolumens bzw. der isokratischen Stufe zu Beginn des Gradienten erfolgen. |
Für die klassische HPLC wurde dem Anwender so ein großzügiger Spielraum gelassen, um die Methode für seine Bedingungen zu optimieren, ohne dass eine Revalidierung der gesamten Methode notwendig ist.
Durch die Entwicklung der UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) und den damit verbundenen neuen Säulenmaterialien („sub-2 µm“) stieß man jedoch rasch an die Grenzen der zulässigen Abweichungen. Um auch die UHPLC konform der Monographien einsetzen zu können, wurde eine Überarbeitung der zulässigen Modifikationen notwendig.
Es folgte eine Revision des Kapitels 621 der USP (USP35-NF30), die die Entwicklungen der letzten Jahre in der HPLC-Analytik berücksichtigt. Dafür wurden folgende Änderungen vorgenommen:
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*ausschließlich bei isokratischer Trennung |
Als Beispiel für die durch die Revision ermöglichten Änderungen isokratischer Methoden wird in USP35-NF30 exemplarisch aufgelistet, welche Kombinationen bei gleichbleibender Bodenzahl zulässig sein werden.
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Die Tabelle zeigt eindrücklich das Potenzial der überarbeiteten Vorgaben. Mit diesen wird durch die größere Flexibilität in der Auswahl der Säulendimensionen der Weiterentwicklung der HPLC zur UHPLC Rechnung getragen. Nach ihrem in Kraft treten wird zukünftig auch der Methodentransfer auf sub-2 µm-Materialen zulässig – und somit auch der zeit- und kosteneffiziente Einsatz der UHPLC möglich sein.
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Die passenden Säulen nach USP finden Sie in unserem HPLC-Säulenkonfigurator.