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Überprüfung der Peakreinheit in der HPLC

Handelt es sich um unbekannte Substanzen, die man untersucht, kann man nie ganz sicher sein, ob es sich um "reine" Peaks handelt, also ob ein Peak wirklich nur einer Substanz zugeordnet werden kann. Doch kann man sich einiger Maßnahmen bedienen, die die Reinheit eines Peaks deutlich erhöhen. An erster Stelle tritt hier natürlich die Kopplung mit MS- oder NMR-Geräten, doch ist hierfür ein hoher apparativer Aufwand mit großer finanzieller Belastung notwendig. Es gibt auch andere Methoden, die kleineren, weniger breit ausgestatteten Laboren durchzuführen sind.

Gegenprobe der Wellenlänge

Zuerst sollte sichergestellt werden, dass alle Substanzen bei der gewählten Wellenlänge detektiert werden. Dies ist am einfachster mit einer Gegenprobe festzustellen: Misst man bei der gängigsten Wellenlänge von 254 nm, kann man als Gegenprobe im kurzwelligen Bereich, zum Beispiel bei 210 nm, messen. Dabei ist allerdings auch auf den UV-cut off des Elutionsmittels zu achten. Arbeitet man mit einem Diodenarraydetektor kann man auf diese Prüfung verzichten, da alle Informationen automatisch bereit gestellt werden.

Verwendung eines weiteren Detektors

Eine weitere Prüfung kann die Verwendung eine anderen Detektors sein, um auch aliphatische Substanzen oder Zucker zu identifizieren. Bei isokratischen Trennungen kann ein Brechungsindex-Detektor verwendet werden. Bei einer Gradientenelution ist dagegen ein Lichtstreudetektor sinnvoll.

Wechsel des HPLC-Geräts oder Eluenten

Auch der Wechsel des HPLC-Geräts und/oder des Eluenten kann weiter Aufschluss über die Reinheit der Peaks liefern. Variablen sind hier die Zusammensetzung des Fließmittels, die Verwendung von Puffern und der pH-Wert. Auch der Austausch der Säule kann zur Sicherstellung der Reinheit beitragen.

Erhält man trotz Veränderung der chromatographischen Bedingungen die gleichen Ergebnisse steigt die Wahrscheinlichkeit, dass man reine Peaks erhalten ha.