Überprüfung der Peakreinheit in der HPLC

Handelt es sich um unbekannte Substanzen, die man untersucht, kann man nie ganz sicher sein, ob es sich um "reine" Peaks handelt, also ob ein Peak wirklich nur einer Substanz zugeordnet werden kann. Es gibt jedoch einige Maßnahmen, die die Reinheit eines Peaks deutlich erhöhen. An erster Stelle steht hier natürlich die Kopplung mit MS- oder NMR-Geräten, die jedoch einen hohen apparativen und finanziellen Aufwand erfordert. Es gibt auch andere Methoden, die von kleineren, weniger gut ausgestatteten Labors durchgeführt werden können.

Wellenlängen-Gegenprobe

Zuerst sollte sichergestellt werden, dass alle Substanzen bei der gewählten Wellenlänge detektiert werden. Dies kann am einfachsten durch eine Gegenprobe überprüft werden: Misst man bei der längsten Wellenlänge von 254 nm, kann man als Gegenprobe im kurzwelligen Bereich, zum Beispiel bei 210 nm, messen. Dabei ist allerdings auch auf den UV-cut off des Elutionsmittels zu achten. Bei Verwendung eines Diodenarraydetektors kann auf diese Überprüfung verzichtet werden, da alle Informationen automatisch zur Verfügung gestellt werden.

Verwendung eines weiteren Detektors

Eine weitere Prüfung kann die Verwendung eines weiteren Detektors sein, um auch aliphatische Substanzen oder Zucker zu identifizieren. Bei isokratischen Trennungen kann ein Brechungsindexdetektor verwendet werden. Bei einer Gradientenelution ist dagegen ein Lichtstreudetektor sinnvoll.

Wechsel des HPLC-Gerätes oder des Eluenten

Auch der Wechsel des HPLC-Gerätes und/oder des Eluenten kann weitere Informationen über die Reinheit der Peaks liefern. Variablen sind hier die Zusammensetzung des Eluenten, die Verwendung von Puffern und der pH-Wert. Auch der Austausch des Fließmittels kann zur Sicherung der Reinheit beitragen.

Erhält man trotz Variation der chromatographischen Bedingungen die gleichen Ergebnisse, steigt die Wahrscheinlichkeit, reine Peaks erhalten zu haben.