Pufferlösungen

Nicht nur im Labor, sondern auch im täglichen Leben kreuzen sich unsere Wege mit sauren und basischen Lebensmitteln, Getränken und Kosmetikprodukten. Abgesehen von weitestgehend neutralen Lösungen wie zum Beispiel dem eigenen Speichel, werden pH-Werte in zwei Bereiche aufgeteilt:

• Azidose: bezeichnet einen Wert unterhalb des pH-Wertes 7,35. Bekannte Beispiele: Magensäure (pH-Wert zwischen 1,2 und 3,0) & Kohlensäure (pH-Wert bei ungefähr 4,68)
• Alkalose: beschreibt einen Wert oberhalb des pH-Wertes 7,45. Bekannte Beispiele: Menschliches Blut (pH-Wert zwischen 7,35 und 7,45) & kosmetische Seife (pH-Wert zwischen 9 und 10)

Als Pufferlösungen werden Stoffe bezeichnet, die eine starke Änderung des pH-Wertes nach der Zugabe einer Säure oder Base abwenden können. Geeignete Pufferlösungen sind entweder Lösungen, die aus einer schwachen Säure und dem Alkalisalz dieser Säure bestehen, oder Gemische aus einer schwachen Base und dem Salz dieser Base.

Temperatur beeinflusst den pH-Wert

Der pH-Wert eines Puffers kann sich je nach Puffersubstanz in Abhängigkeit der Temperatur ändern. Es empfiehlt sich daher den pH-Wert möglichst bei der
Temperatur einzustellen, bei der später gearbeitet werden soll. In den meisten tierischen Zellen liegt der physiologische pH-Wert bei 37°C im Bereich von pH 7,0 – 7,5. Ein besonders stark temperaturabhängiger Puffer ist das Tris (s.o.). Eingestellt auf 7,5 bei 37°C steigt er temperaturabhängig im Testsystem bei 0°C auf ca. 8,5. Bei 0°C wird häufig mit Zellextrakten in vitro gearbeitet (Scopes, 1994). Good-Puffer sind generell gering temperatursensitiv, Carboxylsäure-Puffer (Citrat, Format, Succinat) sogar noch weniger.

Für die praktische Arbeit bedeutet das, dass der einzustellende Puffer auf die entsprechende Temperatur gebracht und die pH-Elektrode entsprechend bei der Arbeitstemperatur geeicht werden sollte. Viele pH-Meter haben heute eine Funktion integriert, die ein Einstellen des pH-Wertes bei Raumtemperatur für abweichende Arbeitstemperaturen (z.B. +4°C oder +37°C) zulässt. Eine Einschränkung erfährt diese Vorgehensweise jedoch dadurch, dass der dpKa/dT-Wert, d.h. der Wert für die Änderung des pKa-Wertes (dpKa) in Abhängigkeit von der Temperaturänderung (dT), nicht für alle Puffer gleich ist. Zum Beispiel ändert sich der pKa-Wert des Tris bei Erhöhung um 1°C um 0,028 Einheiten und der des HEPES nur um 0,014 Einheiten. Ungenauigkeiten sind bei diesem Verfahren unvermeidlich, da diese Werte eigentlich vom pH-Meter berücksichtigt werden müssten.

Titration

Der pH-Wert wird in der Regel mit NaOH/KOH bzw. HCl eingestellt. Bei langsamer Zugabe der Säure oder Lauge unter starkem Rühren wird verhindert, dass lokal
eine hohe Konzentrationen an H+- bzw. OH–-Ionen auftritt. Andernfalls können Puffersubstanzen chemisch so verändert werden, dass sie inaktiviert werden oder
in modifizierter Form hemmend wirken können. Wenn von einem Puffer die protonierte (Säure) und nichtprotonierte (Base) Form zur Verfügung stehen, kann der pH-Wert auch durch Mischen der beiden Substanzen eingestellt werden.

Falls monovalente Kationen stören oder untersucht werden sollen, kann der pH-Wert mit Tetramethyl- oder Tetraethyl-ammonium-Hydroxid eingestellt werden.
Anstelle von HCl können Acetat, Sulfat oder Glutamat verwendet werden, wobei besonders hier die Gefahr der Beeinflussung eines Enzyms besteht.

Einstellung der Ionenstärke

Wie bei der Einstellung des pH-Wertes, sollte auch bei der Wahl des Elektrolytes für die Einstellung der Ionenstärke der Pufferlösung (falls notwendig) vorgegangen
werden, da sie in Abhängigkeit des verwendeten Elektrolyts steigt. Die Salze des Tetramethyl- bzw. Tetraethylammonium sind zum Einstellen der Ionenstärke
geeignet, da die großen Kationen schlechter mit den negativen Ladungen der Enzyme interagieren können. Acetat als großes Anion interagiert seinerseits schlecht mit den Alkalimetallen.

Pufferzusätze

Werden andere Komponenten zum Puffer zugegeben (z.B. EDTA, DTT, Mg2+), ist mit Änderungen des pH-Wertes zu rechnen, weshalb er nachgemessen werden sollte. In der lebenden Zelle wird insbesondere durch Glutathion die Oxidation von Proteinen durch verschiedene Substanzen verhindert. Bei Aufschluss von Zellen muss deshalb in der Regel ein reduzierendes Agens, b-Mercaptoethanol (5 – 20 mM) oder DTT (1 – 5 mM), zugegeben werden. Bereits 24 Stunden nach Zugabe zum Puffer ist b-Mercaptoethanol oxidiert. Es empfiehlt sich daher diese Substanz nur während der Aufarbeitung von Proteinen in den Puffer einzuschließen und für längere Lagerung des Proteins auf DTT zurückzugreifen.

Um das Wachstum von Bakterien oder Pilzen zu verhindern, besonders in Puffern im Bereich pH 6,0 – 8,0, empfiehlt sich eine Sterilfiltration (0,22 μm) bzw. die
Zugabe von 0,02 % (3 mM) Natriumazid. Letzteres wird bei Zugabe zu konzentrierten Stammlösungen im Zuge der Verdünnung zur Arbeitskonzentration ebenfalls so
stark verdünnt, dass es in der Regel nicht mehr stört.

pH-Meter-Kontrolle

Bei der Einstellung des pH-Wertes eines Puffers stehen heute in der Regel akkurate pH-Meter mit digitaler Anzeige zur Verfügung. Das pH-Meter wird mit zwei pH-Standards kalibriert, die den Bereich des einzustellenden Puffers einschließen. Falls Zweifel an der Messgenauigkeit bestehen, kann dies einfach durch Standardisieren des pH-Meters mit einem 50 mM Phosphat-Puffer erfolgen, der dann 10fach verdünnt wird. Der pH-Wert sollte jetzt um 0,2 pH-Einheiten höher liegen.

Wässrige Lösungen, die Nährstoffe für Mikroben ernthaöten, laufen Gefahr zu verkeimen. Dazu gehören auch viele Pufferlösungen. Zur Konservierung der Lösungen werden in der Praxis unterschiedliche Methodenen angewendet:

• Hitze-Sterilisation durch Autoklavieren
• Steril-Filtrieren durch Filter mit Porengrößen ≤0,22µm
• gekühlte Lagerung
• Lagerung als hoch-konzentrierte Stammlösung

Kommerziellen Produkten werden häufig bereits Konservierungsmittel wie Natriumazid zugesetzt.

Autoklavieren von Pufferlösungen

Einige Puffersubstanzen sidn ausreichend stabil, so dass sie problemlos autoklaviert werden können - vorausgesetzt. alle weiteren Bestandteile und Reaktionsprodukte der Pufferlösung sind ebenfalls stabil. So können z.B. Ammonium- und Pyridin-Puffer nicht autoklaviert werden, da sie instabil sind. Carbonat-Puffer können ebenfalls nicht autokalviert werden, da sie in offenen Systemen bereits  ab 20°C als CO₂ freigesetzt werden; ab 100°C geht die Pufferwirkung vollständig verloren. Auch für die folgenden Puffersubstanzen ist Filtration (s. Auflsitung oben) das Mittel der Wahl zum Sterilisieren: HEPES, HEEPS, Imidazol, MOPS, Taurin und TEA.