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Mobile Phasen in der HPLC

Vorbereitung der mobilen Phasen

Eine sorgfältige Zubereitung der Lösemittel ist sehr wichtig. Diese kann erheblichen Zeitaufwand für die Fehlersuche von Störspitzen, Grundrauschen usw. einsparen.

Qualität der Lösemittel

Alle Reagenzien und Lösemittel sollten von höchster Qualität sein (hier finden Sie eine Übersicht über die Reinheitsgrade und Qualitäten). HPLC-Reagenzien kosten i.d.R. etwas mehr als Reagenzien mit niedrigerer Qualität, jedoch ist der Unterschied in der Reinheit auffällig. HPLC-Reagenzien enthalten keine Verunreinigungen, welche zu unerwünschten Peaks in einer Chromatogramm-Basislinie führen könnten, während Reagenzien mit niedrigerer Qualität Spuren von Verunreinigungen enthalten, welche unerwünschte Basislinien-Peaks erzeugen können.

Es muss sichergestellt werden, dass das Wasser, welches in der Pufferherstellung verwendet wird, die höchste Reinheit aufweist. Entionisiertes Wasser enthält häufig Spuren von organischen Verbindungen und wird daher nicht für HPLC-Anwendungen empfohlen. Ultra-reines HPLC-Wasser (18mΩ Widerstandsfähigkeit) wird erzeugt, indem entionisiertes Wasser durch ein Ionenaustauschbett geleitet wird. Moderne Wasserreinigungsinstrumente verwenden diesen Mechanismus, um Wasser von geeigneter Qualität in hohen Volumina zu erzeugen. Vorzugshalber kann Wasser mit HPLC-Qualität von Lösungsmittellieferanten bezogen werden.

Wichtig: Bewahren Sie kein HPLC-Wasser in Kunststoffbehältern auf. Zusatzstoffe des Kunststoffs können in das Wasser gelangen und dieses verunreinigen. Bewahren Sie HPLC-Wasser immer in Glasbehältern auf.

Puffer

Alle Puffer sollten am Verwendungstag frisch zubereitet werden. Dies stellt sicher, dass der pH-Wert der Puffer nicht durch längere Lagerung beeinträchtig wird und das kein mikrobielles Wachstum eintritt. Änderungen im pH-Wert, wie auch mikrobielles Wachstum beeinflussen die Chromatographie.

Beachten Sie, dass wenn Pufferlösungen gelagert werden, diese eine begrenzte Lebensdauer haben. Für weitere Leitlinien bezüglich der Haltbarkeit des Puffers sei auf Pharmacopoeia-Monographien oder ähnliches verwiesen.

Pufferreagenzien können ein Stabilisierungsmittel, beispielsweise Natriummetabisulfit, enthalten. Diese Stabilisierungsmittel beeinflussen oft das optische sowie chromatographische Verhalten von Pufferlösungen, sodass es meist empfehlenswert ist, Reagenzien zu kaufen, welche keinen Stabilisator enthalten. Die Behälter von festen Reagenzien werden durch eine wiederholte Verwendung leicht kontaminiert. Aus diesem Grund empfehlen wir Reagenzien in niedrigen Behältergewichten zu kaufen.

Filtrieren

Idealerweise sollten alle HPLC-Lösungsmittel vor dem Gebrauch mit einem 0,45µm Filter filtriert werden. Durch Einsatz eines Filters werden alle Partikel entfernt, die zu Verstopfungen führen könnten. Nach der Filtration sollten die Lösungsmittel in einem abgedeckten Behälter gelagert werden, um eine erneute Kontamination mit Staub usw. zu verhindern.

Das Filtern der HPLC-Lösungsmittel nutzt sowohl Ihrer Chromatographie, wie auch dem Verschleißen des HPLC-Systems. Die Leistung von Pumpenkolben, Dichtungen und Rückschlagventile wird erhöht und die Lebensdauer maximiert.

Entgasung

Bevor die frisch zubereitete mobile Phase um das HPLC-System gepumpt wird sollte sie gründlich entgast werden, um alle gelösten Gase zu entfernen. Gelöstes Gas kann aus der Lösung entfernt werden durch:

  • Bördeln mit Helium
  • Beschallung
  • Vakuumfiltration

Wenn die mobile Phase nicht entgast wird können sich Luftblasen im Niedrigdruck der Detektorzelle bilden, was wiederum zu Problemen wie Systeminstabilität, falschen Basislinien-Peaks usw. führt.

Die effizienteste Form der Entgasung ist das Brodeln mit Helium oder einem anderen Gas mit niedriger Löslichkeit. Wenn dieses Verfahren verfügbar ist, empfehlen wir, dass die mobile Phase während der gesamten Analyse kontinuierlich auf sehr niedriger Ebene entgast wird. Dies wird die erneute Absorption von Gasen während der Analysezeit hemmen.

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Lösungsmittelbehälter ein Luftloch zur Atmosphäre aufweist, um einen Druckaufbau im Behälter zu verhindern.