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Tipps zur Regeneration und Reinigung von HPLC-Säulen

Für alle Reinigungsschritte sollte die Durchflussrate bei 25 – 50% der normalen Anwendungs-Durchflussrate liegen.

Polare Fremdstoffe

Spülen Sie zuerst Pufferstoffe heraus mit einem Gemisch aus 80% Wasser und 20% organischem Lösungsmittel (Menge: 20-Faches Säulenvolumen). Spülen Sie danach mit einem Gemisch mit einer hohen Konzentration an organischen Lösungsmittel (70:30 bis 90:10, Methanol – Wasser oder Acetonitril – Wasser) und einer Menge von mindestens dem 10-Fachen des Säulenvolumens.

Anmerkung: Die meisten polaren Fremdstoffe sind eluiert, wenn der Puffer herausgespült wurde.

Unpolare Fremdstoffe

  1. Spülen Sie die Säule mit einem hohen Anteil an Wasser (max. 90% Wasser) um Pufferstoffe zu entfernen.
  2. Spülen Sie die Säule mit 100% Methanol um polare organische Verbindungen zu entfernen.
  3. Spülen Sie die Säule mit 100% Acetonitril um schwach polare organische Fremdstoffe zu entfernen(falls notwendig erhöhen Sie die Temperatur auf 40° C).
  4. Spülen Sie die Säule mit THF um unpolare organische Verbindungen zu entfernen.
  5. Falls notwendig spülen Sie die Säule mit THF in umgekehrter Fließrichtung(mit ca. 1/5 der ursprünglichen Durchflussrate).

Proteine und Peptide

Für diese Fremdstoffe empfehlen wir eine Steigerung von Wasser - 0,05% TFA (Eluent A) und Acetonitril - 0,04% TFA (Eluent B) mit einem Anstieg von 25% B auf 100% B in 20 Minuten, dann 5 min mit 100% B und dann innerhalb von 5 min zurück auf 25% B. Wiederholen Sie dieses Verfahren zweimal.

Die gereinigte Säule

Ein wichtiges Merkmal für eine gut gesäuberte Säule ist die Stabilität der Grundlinie (nicht zu verwechseln mit dem Signalrauschen der UV-Lampe). Bei einer konstanten Temperatur (ohne Thermischen Drift) sollte ein  Acetonitril-Wasser- Gemisch von 70:30 bei einer Anwendung von 5min keine Abweichungen von mehr als 2-3 mAU verursachen.