Tipps zur Regeneration und Reinigung von HPLC-Säulen

Für alle Reinigungsschritte sollte die Durchflussrate bei 25 – 50 % der normalen Anwendungs-Durchflussrate liegen.

Polare Fremdstoffe

Spülen Sie zuerst Pufferstoffe heraus mit einem Gemisch aus 80 % Wasser und 20 % organischem Lösungsmittel (Menge: 20-Faches Säulenvolumen). Spülen Sie danach mit einem Gemisch mit einer hohen Konzentration an organischen Lösungsmittel (70:30 bis 90:10, Methanol – Wasser oder Acetonitril – Wasser) und einer Menge von mindestens dem 10-Fachen des Säulenvolumens.

Anmerkung: Die meisten polaren Fremdstoffe sind eluiert, wenn der Puffer herausgespült wurde.

Unpolare Fremdstoffe

1. Spülen Sie die Säule mit einem hohen Anteil an Wasser (max. 90 % Wasser), um Pufferstoffe zu entfernen.
2. Spülen Sie die Säule mit 100 % Methanol, um polare organische Verbindungen zu entfernen.
3. Spülen Sie die Säule mit 100 % Acetonitril, um schwach polare organische Fremdstoffe zu entfernen (falls notwendig erhöhen Sie die Temperatur auf 40° C).
4. Spülen Sie die Säule mit THF, um unpolare organische Verbindungen zu entfernen.
5. Falls notwendig spülen Sie die Säule mit THF in umgekehrter Fließrichtung (mit ca. 1/5 der ursprünglichen Durchflussrate).

Proteine und Peptide

Für diese Fremdstoffe empfehlen wir eine Steigerung von Wasser - 0,05 % TFA (Eluent A) und Acetonitril - 0,04 % TFA (Eluent B) mit einem Anstieg von 25 % B auf 100 % B in 20 Minuten, dann 5 min mit 100 % B und dann innerhalb von 5 min zurück auf 25 % B. Wiederholen Sie dieses Verfahren zweimal.

Die gereinigte Säule

Ein wichtiges Merkmal für eine gut gesäuberte Säule ist die Stabilität der Grundlinie (nicht zu verwechseln mit dem Signalrauschen der UV-Lampe). Bei einer konstanten Temperatur (ohne Thermischen Drift) sollte ein  Acetonitril-Wasser-Gemisch von 70:30 bei einer Anwendung von 5 min keine Abweichungen von mehr als 2-3 mAU verursachen.