Das Totvolumen einer Chromatographie-Säule entspricht dem Volumen an mobiler Phase, das zum Füllen aller Poren und Zwischenräume einer Säulenpackung benötigt wird. Dieses Totvolumen spielt in der Praxis aber weniger eine Rolle als das Totvolumen einer HPLC-Anlage im Ganzen.
Um auch bei kurzen Retentionszeiten eine zufriedenstellende Auflösung zu erhalten, ist es sinnvoll, das Totvolumen zu minimieren. Unter Totvolumen versteht man das Volumen, das das System von der Injektion bis zur Detektorzelle durchfließt ohne mit der Säule Wechselwirkungen einzugehen. Das Totvolumen sollte vor einer Messung bestimmt werden, wenn es sehr früh eluierende Substanzen gibt oder die Trennung der Substanzen nicht zufriedenstellend ist.
Zur Bestimmung des Totvolumens wird das Injektionsventil direkt mit der Detektorzelle verbunden. Es wird ein definiertes Volumen einer UV-aktive Substanz wie z. B. Aceton injiziert. Durch den Peak dieser Substanz kann über das Retentionsvolumen das Totvolumen bestimmt werden. Werte von 20 µl Totvolumen sprechen für sehr gute Anlagen, wobei Werte bis zu 50 µl auch noch zu akzeptieren sind.
Der Innendurchmesser der Kapillaren hat ebenfalls Auswirkung auf das Totvolumen. Bei einem Innendurchmesser von 0,1 mm rechnet man mit einem Totvolumen von 0,1 µl pro cm Säule. Liegt ein Innendurchmesser von 1 mm vor, muss man mit einem Totvolumen von 8 µl pro cm Säule rechnen.
Das injizierte Volumen an sich hat keinen EInfluss auf das Totvolumen. Lediglich sollte vermieden werden, dass sich der Lösungsmittelanteil im Totvolumen mit dem Anteil in der injizierten Probe aufsummiert und es somit zu einem Verdünnungseffekt kommt, der die Trennschärfe negativ beeiflusst.
Um nun das Totvolumen vermeiden zu können, wäre es optimal, die Säule direkt an das Injektionsventil und an die Detektorzellen zu koppeln. Einsätze wie Inline-Filter führen zu Rückmischungen. Zielführend ist ebenfalls eine einheitliche Temperatur in Injektor und Detektor.