Die Säulen-Chromatographie eignet sich besonders zur Trennung größerer Stoffmengen. Als Säule dient in diesem Verfahren ein Glasrohr, welches mit einem Trägermaterial befüllt ist. Als stationäres Trägermaterial kann zum Beispiel Kieselgel oder Cellulose verwendet werden. Die verschiedenen Verbindungen des Gemischs wechselwirken je nach ihrer chemischen Beschaffenheit gut oder weniger gut mit dieser stationären Phase und werden dadurch in unterschiedlichen Fraktionen eluiert.
Das wichtigste Gebiet in der Säulen-Chromatographie ist die HPLC.